Senin, 25 November 2013

TEKNIK PENYIMPANAN KULTUR MURNI DAN MENGKARAKTERISASI PERTUMBUHAN KOLONI MURNI HASIL ISOLASI

BAB I
PENDAHULUAN
1.1  Latar Belakang
Mikroba yang ditemukan di suatu lingkungan ditemukan dalam populasi campuran, sangat jarang sekali yang ditemukan sebagai satu spesies tunggal. Penelitian mengenai mikroorganisme biasanya memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran pada permulaanya, atau biakan campuran, menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang berasal dari satu sel induk (Prescott, 2003). Hal lain yang perlu diperhatikan adalah pemeliharaan kemurnian isolat selama penyimpanan, agar produk atau metabolisme suatu mikroba termasuk kapang tetap terjaga. Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan akan membantu di dalam mengkultivasi, mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba, karena mikroba memiliki karakteristik dan ciri yang berbeda-beda di dalam persyaratan pertumbuhannya.
Suatu jenis koloni mikroba yang terpisah dari koloni campurannya akan lebih mudah  untuk diamati. Selain itu teknik untuk memisahkan dan mendapatkan koloni tunggal serta pemeliharannya terdapat beberapa jenis. Teknik-teknik tersebut memiliki kelebihan dan kelemahan. Beberapa cara dapat dilakukan untuk menentukan jumlah bakteri yang terdapat pada bahan pemeriksaan. Cara yang paling sering digunakan adalah cara penghitungan koloni pada lempeng pembiakan (plate count), atau juga  dapat dilakukan penghitungan langsung secara mikroskopis  (Burrows, 2004). Oleh karena itu, untuk mempelajari teknik isolasi, pemurnian mikroba, serta keuntungan dan kelemahannya, maka praktikum Isolasi dan Pemurnian Mikroba, Teknik Pemeliharaan Kultur Murni penting untuk dilakukan.

1.2  Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik penyimpanan kultur murni dan mengkarakterisasi pertumbuhan koloni murni hasil isolasi.


1.3  Manfaat
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa akan mempunyai keterampilan serta keahlian dalam mengisolasi, memurnikan dan memelihara suatu biakan dengan beberapa macam teknik, sehingga memudahkan isolasi, pemurnian yang dilakukan di lapangan serata menyimpan biakan tersebut.



BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah-pisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni, yaitu sekelompok massa sel yang dapat dilihat dengan mata telanjang. Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum, dengan menginokulasi medium agar nutrien (nutrien agar) dengan metode cawan gores atau media cawan tuang, sel-sel mikroorganisme akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba individu memperbanyak diri secara cepat sehingga dalam waktu 18 sampai 24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan dinamakan koloni. Koloni dapat terlihat oleh mata telanjang. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme (Pelczar dan Chan, 2007).
Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap hidup merupakan suatu hal yang penting untuk diketahui. Pengetahuan tentang faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba sangat penting di dalam mengendalikan mikroba. Berikut ini faktor-faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba (Suriawiria, 2005):
a. Suplai Energi
 Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah : karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan kematian.
            Kondisi tidak bersih dan higinis pada lingkungan adalah kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba sehingga mikroba dapat tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh karena itu, prinsip daripada menciptakan lingkungan bersih dan higinis adalah untuk mengeliminir dan meminimalisir sumber nutrisi bagi mikroba agar pertumbuhannya terkendali.

b. Suhu/Temperatur
            Suhu merupakan salah satu faktor penting di dalam mempengaruhi dan pertumbuhan mikroorganisme. Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara yang berlawanan. Apabila suhu naik maka kecepatan metabolisme naik dan pertumbuhan dipercepat. Sebaliknya apabila suhu turun, maka kecepatan metabolisme akan menurun dan pertumbuhan diperlambat. Apabila suhu naik atau turun secara drastis, tingkat pertumbuhan akan terhenti, kompenen sel menjadi tidak aktif dan rusak, sehingga sel-sel menjadi mati. Berdasarkan hal di atas, maka suhu yang berkaitan dengan pertumbuhan mikroorganisme digolongkan menjadi tiga, yaitu : Suhu minimum yaitu suhu yang apabila berada di bawahnya maka pertumbuhan terhenti.  Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan berlangsung paling cepat dan optimum. (Disebut juga suhu inkubasi).  Suhu maksimum yaitu suhu yang apabila berada di atasnya maka pertumbuhan tidak terjadi.
Berdasarkan ketahanan panas, mikroba dikelompokkan menjadi tiga macam, yaitu :
 Peka terhadap panas, apabila semua sel rusak apabila dipanaskan pada suhu 60oC selama 10-20 menit. Tahan terhadap panas, apabila dibutuhkan suhu 100oC selama 10 menit untuk mematikan sel. Thermodurik, dimana dibutuhkan suhu lebih dari 60oC selama 10-20 menit tapi kurang dari 100oC selama 10 menit untuk mematikan sel.

c.  Keasaman atau Kebasaan (pH)
Setiap organisme memiliki kisaran pH masing-masing dan memiliki pH optimum yang berbeda-beda. Kebanyakan mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran ph 8,0 – 8,0 dan nilai pH di luar kisaran 2,0 sampai 10,0 biasanya bersifat merusak.

d.  Ketersediaan Oksigen
Mikroorganisme memiliki karakteristik sendiri-sendiri di dalam kebutuhannya akan oksigen. Mikroorganisme dalam hal ini digolongkan menjadi  Aerobik : hanya dapat tumbuh apabila ada oksigen bebas.  Anaerob : hanya dapat tumbuh apabila tidak ada oksigen bebas.  Anaerob fakultatif : dapat tumbuh baik dengan atau tanpa oksigen bebas. Mikroaerofilik : dapat tumbuh apabila ada oksigen dalam jumlah kecil (Tortora, 2002).
Metode-metode yang dapat digunakan untuk mengisolasi biakan murni mikroorganisme antara lain cawan gores (sterak plate), cawan tebar, dan cawan tuang.
1.      Teknik Dilusi (Pengenceran)  
             
Gambar 1. Teknik Dilusi (Rachdie, 2008)
            Teknik dilusi sangat penting di dalam analisa mikrobiologi. Karena hampir semua metode perhitungan jumlah sel mikroba mempergunakan teknik ini, seperti TPC (Total Plate Count).
Cara Kerja :
-
          Dari larutan kultur kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian.
-          Dari larutan dilusi 1/10 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian.
-          Dari larutan dilusi 1/100 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1000 bagian.
-          Dari larutan dilusi 1/1000 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian.
-          Dan seterusnya
Maksud dari 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 dst adalah suatu rasio dilusi yang apabila pada tiap dilusi ditumbuhkan ke dalam suatu media dan koloninya yang tumbuh dapat dihitung, maka jumlah sel mikroba dapat diketahui dengan cara :
Jumlah koloni x
1
Pengenceran
Misal :
Apabila pada dilusi 1/100 tumbuh sebanyak 20 koloni, maka dapat diketahui jumlah sel adalah :
20 koloni x
1
= 2000 sel
1/100
Apabila pada dilusi 1/1000 tumbuh sebanyak 3 koloni, maka dapat diketahui jumlah sel adalah :
2 koloni  x
1
= 3000 sel
1/1000
Oleh karena itu, dengan metode dilusi kita dapat memperkirakan jumlah sel mikroba pada suatu benda atau produk.
2. Teknik Pour Plate (Lempeng Tuang)
Teknik Pour Plate adalah suatu teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar cair dengan stok kultur. Teknik ini umumnya digunakan pada metode Total Plate Count (TPC). Sedangkan teknik streak plate adalah suatu teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme dalam media agar dengan cara menggores (streak) permukaan agar dengan jarum yang telah diinokulasi dengan kultur mikroba. Teknik ini menjadikan mikroorganisme tumbuh dan tampak pada goresan-goresan inokulasi bekas jarum (Radchie, 2008).

3. Teknik Streak Plate
     
Gambar 2 . Teknik Streak Plate  (Rachdie, 2008)
            Teknik streak plate (lempeng gores) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menstreak (menggores) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur bakteri. Dengan teknik ini mikroorganisme yang tumbuh akan tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas dari streak jarum enten.
4. Pemeliharaan Kultur pada Slant Agar
http://www.mansfield.ohio-state.edu/%7Esabedon/black06_files/image005.gif
                                    (a)                                                                               (b)
Gambar 3. Teknik Slant Agar. (a) memasukkan kultur pada slant agar (b) bagian-bagian yang akan dipindahkan  (Rachdie, 2008)
            Agar slants adalah kultivasi biakan mikroba ke dalam agar miring di dalam tabung reaksi untuk melihat karakteristik koloni bakteri yang tumbuh. Tiap bakteri memiliki karakteristik koloni yang berbeda. Karakteristik yang diamati pada koloni bakteri yang tumbuh adalah (Rachdie, 2008):
 Karakteristik Pertumbuhan Koloni Bakteri
Ukuran : Diameter koloni yang diukur di dalam mm atau cm
Bentuk Keseluruhan Koloni : Sirkular, irregular, punctiform, rhizoid
Tepi / Margin : Entire, lobate, erose, undulate
Elevasi : Datar (flat), raised, convex (cembung), pulvinate, umbonate, crateriform
Permukaan : Wrinkled, rough (kasar), concentric rings, dull, glistening, waxy
Pigmentasi :
Warna : merah, kuning, krim, putih, tidak berwarna
Kelarutan dalam air : larut dalam air, tidak larut dalam air
Opasitas : Transparan, translucent, opaque
Bau : manis, putrefactive, fruity











BAB III
METODE PRAKTIKUM


3.2  Cara Kerja
3.2.1  Teknik  Dilusi (Pengenceran)
Sampel (tanah murni dan tanah yang ditambah dengan pestisida) ditimbang sebanyak 5 mg dan dimasukkan ke dalam 45 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian. Dari larutan dilusi 1/10 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian. Dari larutan dilusi 1/100 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/1.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/10.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/100.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1.000.000 bagian.

3.2.2  Teknik Pour Plate (Lempeng Tuang)
Diambil sampel sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran berseri pada teknik dilusi dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril, cawan segera ditutup agar terhindar dari kontaminan. Masing-masing cawan petri berisis hasil pengenceran ditambahkan dengan Potato Dextrose Agar (PDA) untuk kapang, dan media Nutrient agar (NA) untuk bakteri. Segera setelah media dimasukkan, cawan petri diputar secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. Setelah memadat, cawan-cawan tersebut diletakkan dalam posisi terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar, untuk kapang dan bakteri dilakukan inkubasi minimal selama 3x24 jam. Karakteristik koloni yang tumbuh diamati.


Cara Kerja Isolasi Bakteri

  • Sample seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8
  • Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam
  • Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali
  • Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran
  • Inkubasi 1x24 jam.
clip_image052clip_image054












BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisis Prosedur
4.1.1 Teknik Dilusi (Pengenceran)
Teknik dilusi sangat penting di dalam analisis mikrobiologi, karena hampir semua metode perhitungan jumlah sel mikroba diawali teknik ini. Teknik dilusi dilakukan untuk benar-benar mendapatkan koloni tunggal. Sampel (tanah murni dan tanah yang ditambah dengan pestisida) ditimbang sebanyak 5 mg dan dimasukkan ke dalam 45 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian. Dari larutan dilusi 1/10 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian. Dari larutan dilusi 1/100 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/1.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/10.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/100.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1.000.000 bagian. Maksud dari 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 hingga seterusnya merupakan suatu rasio dilusi yang apabila pada tiap dilusi ditumbuhkan kedalam suatu media dan koloninya yang tumbuh dapat dihitung. Pengenceran dilakukan untuk mendapatkan koloni yang akan diisolasi dengan meminimalkan kontaminasi dan penambahan nutrisi untuk mikroba

4.1.2 Teknik Pour Plate
Pada teknik pour plate, mula-mula diambil sampel sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran berseri pada teknik dilusi dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril, cawan segera ditutup agar terhindar dari kontaminan. Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan media yang digunakan untuk menumbuhkan kapang, sedangkan Nutrient Agar (NA) merupakan media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri, media ini dipanaskan agar mencair, kemudian sedikit didinginkan sehingga suhunya kira-kira 40-50°C, pendinginan ini dilakukan untuk mendapatkan suhu yang ideal sehingga agar tidak mengeras namun tidak terlalu panas yang mengakibatkan kematian koloni yang akan dibiakkan.. Masing-masing cawan petri berisi hasil pengenceran ditambahkan dengan Potato Dextrose Agar (PDA) untuk kapang, dan Nutrien Agar (NA) untuk bakteri. Segera setelah media dimasukkan, cawan petri diputar secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. Setelah memadat, cawan-cawan tersebut diletakkan dalam posisi terbalik. Cawan diletakkan dalam posisi terbalik berfungsi untuk mencegah kondensasi menitis dari bawah ke atas permukaan agar yang dapat memfasilitasi pergerakan organisme antara koloni (Sciencestuff, 2008). Inkubasi dilakukan pada suhu 300C (jika tergolong mikroba mesofil) dengan lama inkubasi 24 jam untuk bakteri dan paling sedikit 3x24 jam untuk kapang. Perbedaan waktu inkubasi adalah karena waktu pertumbuhan dan perkembangbiakkan antara bakteri dan kapang berbeda. Inkubasi dilakukan untuk memberikan suasana yang memungkinkan (optimal) untuk pertumbuhan bakteri dan kapang hingga terbentuk koloni. Inkubasi dilakukan dengan posisi cawan terbalik. Hal ini dilakukan agar untuk mencegah kondensasi menitis dari bawah ke atas permukaan agar yang dapat memfasilitasi pergerakan organisme antara koloni (Sciencestuff, 2008). Karakteristik koloni yang tumbuh diamati.

4.2 Data Hasil Praktikum
Tabel 1. Hasil Penghitungan Bakteri
No.
Pengenceran
∑ Koloni Cawan
∑ Sel Mikroba Tiap
ml/gr bahan
Ulangan I
Ulangan II
P 1
10-2
128
32
8 x 105
10-3
49
17
10-4
5
15
10-5
1
2
10-6
3
3
NP 2
10-2
42
43
4,25 x 105
10-3
7
18
10-4
12
15
10-5
-
3
10-6
3
2



            4.3 Analisa Hasil
  Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan diketahui bahwa hasil TPC berhubungan dengan seri pengenceran. Hal ini dikarenakan dengan melakukan pengenceran berseri, maka jumlah mikroba yang tersuspensi di dalam cairan menjadi lebih kecil., hal ini terlihat dari jumlah mikroba yang teramati setelah pengenceran hingga ke enam kalinya, bahwa umumnya semakin banyak pengenceran yang dilakukan maka jumlah mikroba yang terhitung semakin sedikit.
Berdasarkan pengamatan yang dilakukan, didapatkan bahwa jumlah koloni pada media dengan penambahan pestisida lebih banyak daripada koloni non-pestisida. Hal ini bisa disebabkan karena bakteri maupun kapang yang ditumbuhkan pada media dengan penambahan pestisida memiliki resistensi yang sangat tinggi dibandingkan pada media non-pestisida, sehingga jumlah koloni yang terbentuk pun akan semakin banyak.

Karakterisasi Bakteri
ž  Media Nutrient Agar Non Pestisida
Bentuk bakteri yang telah didapat dari hasil isolasi murni adalah dengan bentuk bulat, berfilamen, dan tidak teratur. Konfigurasi bakteri yang didapat adalah dengan tepi yang menyeluruh, erose, lobate, dan beralun. Kebanyakan dari konfigurasi bakteri adalah menyeluruh. Elevasi merupakan bentuk pada permukaan bakteri dengan permukaan  cembung dan pulvinat. Tekstur dari bakteri yang didapat sebagian besar adalah berkontur. Tekstur berkontur merupakan tekstur dimana permukaan dari sel bakteri adalah licin dan beralun secara tidak teratur. Konsistensi pada sel bakteri  seperti mentega dan pertumbuhannya mengikuti bekas garsan bekas inokulasi. Ciri optik pada bakteri adalah opalesens yaitu seperti warna putih-kebiruan atau warna susu dengan ciri warna yang kelihatan berubah-ubah, dan berkilat. Pigmentasi pada bakteri sebagian besar memiliki warna kuning, putih tulang, dan putih.

ž  Media Nutrient  Agar Pestisida
Bentuk dari bakteri pada media NA dengan pestisida semua berbentuk bulat. Konfigurasi pada bakteri semuanya adalah menyeluruh. Elevasi pada bakteri adalah cembung dan menaik dengan tekstur berkontur. Konsistensi seperti mentega dengan ciri optik berkilat dan opalesens. Pigmentasi pada bakteri berwarna putih, hitam, dan tidak berwarna.





















BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Teknik penyimpanan mikroorganisme terlebih dahulu dilakukan Isolasi. Isolasi  mikroorganisme dilakukan dengan teknik dilusi atau pengenceran, dimana hasil dari teknik ini adalah 6 sampel, yaitu 10-1 - 10-6  pengenceran. Pengenceran ini merupakan langkah awal untuk mendapatkan isolat jamur yang baik. Tahap berikutnya adalah menggunakan teknik Pour Plate. Teknik ini akan memisahkan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme, dimana dilakukan dengan mencampurkan media agar cair dengan kultur bakteri hasil dilusi. Pemeliharaan bakteri dapat dilakukan pada agar slants atau biasa disebut agar miring. Karakteristik mikroorganisme dilakukan melalui pengamatan langsung dibawah mikroskop. Karakteristik bakteri terdiri atas bentuk, konfigurasi, elevasi, tekstur, konsistensi, ciri optik dan pigmentasi. Sedangkan karakteristik jamur ditentukan miselium, bentuk, konfigurasi, garis radial dan pigmentasi.











DAFTAR PUSTAKA

Burrows, W., J.M. Moulder, and R.M. Lewert. 2004. Texbook of Microbiology. W.B. Saunders Company, Philadelphia.
Curtis, L., A. Lieberman, M. Stark, W. Rea & M. Vetter. 2004. Isolation. http:// www.e-dukasi.net /. Diakses pada tanggal 17 April 2010
Lim,D. 2006. Microbiology, 4th Edition. McGrow-hill book, New york.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book Company. New York.
Prescott, L.M. 2003. Microbiology 5th edition. Mc Graw Hill. New York
Rachdie. 2008. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba. http://rachdie .blogsome.com/2006/10/14/faktor-yang-mempengaruhi-pertumbuhan-mikroba/. Diakses pada tanggal 17 April 2010
Sulistinah, N. 2006. Mikroba Pentranformasi Adiponitril di Palembang. Jurnal Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia : 1-8
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.
Tortora,G. Y, Berdell.R.F, Christine,L.C. 2002. Microbiology an Introduction. Benjamin Cummings, Addrson Wesley Long man Inc. New York

Tidak ada komentar:

Posting Komentar